人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2（ALDH2）是人体酒精代谢中的关键酶。研究人员利用定点诱变技术对ALDH2基因进行改造后在大肠杆菌中表达，获得具有较好溶解性的乙醛脱氢酶2。所用质粒和操作过程如图。其中，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因，Tet^r为四环素抗性基因。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Amp^r转录的模板链属于a链的片段。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端（其中一条链）的序列为5′-ATCCATGCGCTC…（中间核苷酸序列）CAGTGAGTAGCG-3′。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XhoⅠ	XbaⅠ
识别序列和切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	C↓TCGAG	T↓CTAGA

（1）通过定点诱变技术可制备自然界原本

不存在

不存在

（选填“存在”或“不存在”）的蛋白质。
（2）质粒复制的模板链是

a和b

a和b

（选填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）链，基因Tet转录的模板链属于

b链

b链

的片段。若用Xh0I切割质粒后，形成的单链末端碱基序列为

TCGA—

TCGA—

。
（3）过程②需要的酶是

限制酶（或BamHⅠ、XabⅠ）和DNA连接酶

限制酶（或BamHⅠ、XabⅠ）和DNA连接酶

。过程③常采用

CaCl₂

CaCl₂

处理以提高操作效果。经过程④，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有

导入空白质粒的和导入重组质粒的

导入空白质粒的和导入重组质粒的

。
（4）为扩增目的基因，某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用（符合题意）的一对引物是

②⑤

②⑤

（选填数字序号）。根据选定的引物，至少需经过

6

6

次循环，可获得32个符合要求的目的基因。
①5′-TCTAGAATCCATGCGCTC-3′
②5′-TCTAGACGCTACTCACTG-3′
③5′-CTGCAGATCCATGCGCTC-3′
④5′-GGATCCCGCTACTCACTG-3′
⑤5′-GGATCCATCCATGCGCTC-3′
⑥5′-CTCGAGCGCTACTCACTG-3′