酯酶结合荧光分析法可对有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测，某研究院利用转基因技术获得一种催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶，图甲是此基因工程操作时用到的质粒，其中不同数字代表不同的限制酶切点，回答下列问题：

（1）基因工程的核心操作是

基因表达载体的构建

基因表达载体的构建

。在此核心操作过程中应选用

1和3

1和3

（填图中数字）两种限制酶切割目的基因和质粒，选用两种酶而不选择一种酶进行切割的目的是

避免目的基因及质粒自连、避免目的基因反接

避免目的基因及质粒自连、避免目的基因反接

。除图示外，该质粒若作为载体还必须具有的结构

复制原点

复制原点

。
（2）人工合成酯酶基因后通过PCR技术可实现扩增，该过程需要的原料是

脱氧核苷酸

脱氧核苷酸

；设计引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的

3′

3′

（填3′端或5′端）开始连接脱氧核苷酸。为方便构建得组质粒，需要在引物的5′端设计

限制

限制

酶的识别序列。目的基因的序列如图乙所示，应选择引物

①和③

①和③

（填数字）。（①-④中前3个加粗碱基表示保护碱基。）
①5′-CCGATGCTTGATATGCCAATC-3′
②3′-CCGATGCTTGATATGCCAATC-5′
③5′-CCGCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
④3′-CCGCTAGTCGAACACAAGAAG-5′
（3）将PCR产物和质粒用限制酶酶切，酶切产物纯化后，用DNA连接酶连接，此酶按来源不同有两类，即

T4

T4

DNA连接酶和

E.coli

E.coli

DNA连接酶。连接的产物导入大肠杆菌前需

Ca²⁺

Ca²⁺

处理大肠杆菌，使其处于感受态。