微生物农药是指以细菌、真菌、病毒和原生动物或经基因修饰的微生物活体为有效成分，防治病、虫、草、鼠等有害生物的生物源农药。研究发现，萝卜抗真菌蛋白（RS-AFPs）由RS-AFP2基因序列控制合成，是一类富含半胱氨酸的碱性蛋白质，具有抗丝状真菌活性，是天然免疫体系中的重要效应分子。萝卜抗真菌蛋白能够保护种子的正常萌发以及保护植物组织免受病原菌的危害而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达RS-AFPs的转基因大肠杆菌作为微生物农药，相关研究如图。
（1）科学家用

限制性内切核酸酶和DNA连接酶

限制性内切核酸酶和DNA连接酶

处理RS-AFPs基因和质粒以获得重组质粒，再将重组质粒置于

Ca²⁺

Ca²⁺

处理的大肠杆菌细胞悬液中，该处理的作用是

使大肠杆菌细胞处于感受态，便于重组质粒的导入

使大肠杆菌细胞处于感受态，便于重组质粒的导入

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（2）检测发现，转入的RS-AFPs基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低。研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与RS-AFPs基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基）如图1所示，并按如图2方式依次进行4次PCR扩增，已得到新的RS-AFPs基因。这种定点的基因突变技术在图2所示的4次PCR应该分别如何选择下表所示的引物？请填写一下表格（若选用该引物画“Ο”，若不选用该引物则不做标记）。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	Ο Ο	Ο Ο
PCR2			Ο Ο	Ο Ο
PCR4	Ο Ο			Ο Ο

（3）研究者进一步将含有新的RS-AFP2基因的重组质粒和含有RS-AFP2基因的重组质粒以及

空质粒

空质粒

分别导入大肠杆菌。提取培养液中的蛋白质，用

抗原—抗体杂交

抗原—抗体杂交

方法检测并对结果进行比较，从而判断新的RS-AFP2基因表达效率是否提高；为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表的产物加入长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较

抑菌圈

抑菌圈

的大小，以确定表达产物的生物活性大小。以上两种方法是从

分子和个体

分子和个体

水平上对转基因大肠杆菌进行检测和鉴定。
（4）作为微生物农药，与使用传统的化学农药相比，其优点是

对人畜安全、不污染环境等

对人畜安全、不污染环境等

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