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科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果,现以p-B质粒为载体,构建 AH基因的cDNA文库。图1表示p-B质粒,其中Cm/表示氯霉素抗性基因,cdB 基因表达产物能抑制大肠杆菌 DNA 复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点,且不同种限制酶识别序列不同,其中AiuI、XbaI、SspI和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是 AG'CT、T'CTAGA、AAT'ATT、C'AATTG。请分析并回答下列问题:

(1)为获得AH基因的cDNA,先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取RNARNA,再通过反转录反转录合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取,则难以成功,原因是AH基因在其他组织细胞中不表达,(提取不到AH基因的RNA)AH基因在其他组织细胞中不表达,(提取不到AH基因的RNA)。
(2)若已知AH基因的cDNA两端部分序列为:5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTCT-3',请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列),并标明5'和3'端:5'-AACTATGCGC-3'5'-AACTATGCGC-3',5'-AGAGGCTACG-3'5'-AGAGGCTACG-3'。一个初始双链cDNA经四轮循环后,共消耗这两种引物的数量为3030个。
(3)利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时,宜选用限制酶Aiu I和Mfe lAiu I和Mfe l双酶切质粒,再选用限制酶Ssp I和Me ISsp I和Me I切割目的基因,将切割后获得的DNA片段混合,经DNA连接酶处理后,再与大肠杆菌混合培养,在含有适量氯霉素的培养基中添加适量冷的CaCl2CaCl2,以促进转化。
(4)经上述处理培养后,其中能繁殖的大肠杆菌中应含有的质粒是重组质粒(及ccdB基因被破坏的空白质粒)重组质粒(及ccdB基因被破坏的空白质粒),原因是质粒中的ccdB基因被破坏,不能抑制DNA复制质粒中的ccdB基因被破坏,不能抑制DNA复制。
【考点】基因工程的操作过程综合.
【答案】RNA;反转录;AH基因在其他组织细胞中不表达,(提取不到AH基因的RNA);5'-AACTATGCGC-3';5'-AGAGGCTACG-3';30;Aiu I和Mfe l;Ssp I和Me I;CaCl2;重组质粒(及ccdB基因被破坏的空白质粒);质粒中的ccdB基因被破坏,不能抑制DNA复制
【解答】
【点评】
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发布:2024/12/29 8:0:2组卷:12引用:1难度:0.6
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