野生型黑麦草细胞壁中较高的木质素含量会降低其作为青储饲料的品质。D蛋白是催化木质素合成的关键酶，某研究小组通过构建含D基因部分序列正、反向片段的表达干扰载体（如图所示），在细胞内产生双链RNA分子，诱导D基因的mRNA持续降解，培育得到低木质素含量的黑麦草。
（1）D基因的正、反向目的片段的克隆：提取野生型黑麦草叶片全部mRNA，逆转录逆转录成cDNA。根据cDNA序列选取合适的片段，分别设计正、反向目的片段的上下游引物，正向片段和反向片段引物的扩增序列 相同相同（相同/不同），酶切位点 不同不同（相同/不同），以使目的片段定向插入载体的特定位置。扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带回收后与载体连接，形成克隆载体以用于正、反目的片段的扩增。
（2）构建D基因的表达干扰载体：
Ⅰ．对含有正向片段的克隆载体和反向片段的克隆载体分别进行双酶切，将回收片段与经相同酶切的中间载体用 DNA连接酶DNA连接酶酶进行连接，获得含有干扰片段的重组中间载体；为使干扰片段能在受体细胞中复制，中间载体需有 复制起点复制起点。
Ⅱ．将干扰片段和超表达启动子插入Ti质粒的 T-DNAT-DNA得到D基因的表达干扰载体，插入超表达启动子的目的是 促进正、反向目的片段（干扰片段）的转录，得到足量的相应RNA分子促进正、反向目的片段（干扰片段）的转录，得到足量的相应RNA分子。
（3）导入和培养：将D基因的表达干扰载体导入农杆菌。黑麦草愈伤组织在菌液中浸没5min,先置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，再转入无菌水浸润的滤纸上共培养3天，共培养的目的是 使携带干扰片段（目的片段）的T-DNA整合到受体细胞（黑麦草愈伤组织细胞）染色体DNA上使携带干扰片段（目的片段）的T-DNA整合到受体细胞（黑麦草愈伤组织细胞）染色体DNA上。筛选得到的愈伤组织经 再分化再分化过程，培育得到再生植株。
（4）鉴定和筛选：对转基因植株与 野生型（或非转基因）野生型（或非转基因）植株进行木质素含量测定与分析，筛选保留木质素含量显著 降低降低的植株。
【考点】基因工程的操作过程综合；植物的组织培养．
【答案】逆转录；相同；不同；琼脂糖凝胶电泳；DNA连接酶；复制起点；T-DNA；促进正、反向目的片段（干扰片段）的转录，得到足量的相应RNA分子；使携带干扰片段（目的片段）的T-DNA整合到受体细胞（黑麦草愈伤组织细胞）染色体DNA上；再分化；野生型（或非转基因）；降低
【解答】
【点评】
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发布：2024/12/9 19:30:2组卷：7引用：2难度：0.5
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发布：2025/1/5 8:0:1组卷：6引用：1难度：0.7 -
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3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
