PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点）

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTGGTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACCCCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCCCCTAG↑G

（1）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

EcoRⅠ和

EcoRⅠ和

和

PvitⅠ

PvitⅠ

两种不同限制酶的识别序列。对于酶切的phb2基因和载体进行连接，选择两种限制酶切比用一种限制酶切好的原因：

可以防止目的基因和质粒的自身环化，也可以防止目的基因和质粒的反向连接

可以防止目的基因和质粒的自身环化，也可以防止目的基因和质粒的反向连接

。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
（2）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，

3

3

号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
（3）根据PHB2cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物如图，通过PCR扩增PHB2基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为

引物1和引物4

引物1和引物4

，pcr扩增时选取的DNA往往类似于图，而目的基因往往只是其中的一个片段类似于AB段，当pcr扩增至第四轮循环时等长的目的基因片段占

1

2

1

2

。