17α-羟基孕酮是合成孕激素等甾体类激素的重要中间体，由CPY17酶催化孕酮而产生。科研人员利用转基因技术建构了CYP17酶稳定高表达的酵母菌株，对甾体类药物的生产具有重要意义。

（1）GSII5酵母菌常作为基因工程的受体菌。因其具有

内质网和高尔基体

内质网和高尔基体

（细胞器），可对分泌蛋白进行加工和分泌。GSII5含有AOX1基因，其转录受甲醇的诱导，表达后可高效分解甲醇，促进其增殖。由于HIS4基因（组氨酸合成基因）突变为his4，GSII5为组氨酸缺陷型，因此将基因表达载体导入GSII5时，可将HIS4作为

标记

标记

基因。
（2）扩增CYP17基因时，在上下游引物中分别加入

BamHI和NotI

BamHI和NotI

限制酶的识别序列，以便与图1质粒构建正确连接的基因表达载体。将其导入大肠杆菌进行自我复制。
（3）从大肠杆菌中提取基因表达载体导入GSII5中。由于存在同源序列，表达载体与酵母染色体会发生双交换（图2）或单交换（图3），将目的基因整合到酵母的染色体上。
①两种方式均可以在

缺乏

缺乏

（含有/缺乏）组氨酸的培养基中筛选出成功转化的GSII5。
②图2所示方式转化的GSII5在含有甲醇的培养液中增殖缓慢，其原因是

由于AOX1基因被敲除（部分序列被替换），从而失去高效利用甲醇的能力，故增殖缓慢

由于AOX1基因被敲除（部分序列被替换），从而失去高效利用甲醇的能力，故增殖缓慢

。
③为提高图3所示单交换的成功率，科研人员选择用

SalI

SalI

酶处理基因表达载体并成功导入GSII5，检测到CYP17基因以图3所示方式整合到了染色体上。
（4）进一步对CYP17酶的催化中心结构进行分析，推测将第105位的丙氨酸替换为亮氨酸可提高其催化效率。为验证推测，利用点突变技术获得了改造后的表达载体。并在定期添加甲醇的含有

孕酮

孕酮

的培养液中培养，一段时间后检测发酵液中17α-羟基孕酮的含量，发现改造后的酶cyp17具有更高的催化活性。请简述对CYP17酶改造的基本步骤。