家禽体内缺少能降解纤维素的酶，影响了家禽对谷物饲料中纤维素的吸收和利用。科研人员将W基因（编码一种降解纤维素的酶）导入乳酸杆菌细胞内，再将其添加到谷物饲料中，以提高家禽对纤维素的利用。回答下列问题。
（1）如图1是从枯草芽孢杆菌细胞克隆得到的含W基因的DNA片段，其中乙链是转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为5′→3′。图2是所用的质粒载体。图中EcoRⅠ、BamHⅠ、KpmⅠ、MfeⅠ、HindⅢ是限制酶及其切割位点（均形成黏性末端）。

限制酶	EcoRⅠ	BamHⅠ	KpnⅠ	MfeⅠ	HindⅢ
识别位点	5′G↓AATTC 3′ 3′CTTAA↓G5′	5′G↓GATCC3′ 3′CCTAG↓G5′	5′GGTAC↓C3′ 3′C↓CATGG5′	5′C↓AATTG3′ 3′GTTAA↓C5′	5′A↓AGCTT3′ 3′TTCGA↓A 5′

①为使W基因在乳酸杆菌中表达，构建基因表达载体时，切割含W基因的DNA片段需选用EcoRⅠ和HindⅢ限制酶，切割质粒的限制酶最佳选用

Mfe I

Mfe I

和HindⅢ，再通过DNA连接酶能将W基因与质粒进行拼接成重组质粒，说明除HindⅢ外，所选限制酶应要满足的条件是

与EcoR I具有相同的黏性末端，且能保证目的基因和质粒正确连接

与EcoR I具有相同的黏性末端，且能保证目的基因和质粒正确连接

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②将所得的重组质粒转化乳酸杆菌后，可用含氨苄青霉素的培养基筛选，得到的乳酸杆菌还需进行分子水平检测是否导入了W基因，原因是

用含氨苄青霉素的培养基筛选，得到的乳酸杆菌可能为导入重组质粒或空白质粒的乳酸杆菌

用含氨苄青霉素的培养基筛选，得到的乳酸杆菌可能为导入重组质粒或空白质粒的乳酸杆菌

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（2）对导入重组质粒的乳酸杆菌还需进行个体生物学水平的检测，以确定目的基因（W基因）是否起作用。检测过程如下：
①配制固体鉴定培养基：除加入水、无机盐、刚果红、维生素、氮源、琼脂外，还需要添加

纤维素

纤维素

。
②将培养的乳酸杆菌、

导入了空白质粒的乳酸杆菌

导入了空白质粒的乳酸杆菌

和导入了重组质粒的乳酸杆菌菌液分别接种于固体鉴定培养基上（编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组）。
③观察结果：只有导入了重组质粒的乳酸杆菌在此培养基上出现了

透明圈

透明圈

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