PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经

逆转录

逆转录

过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，在利用PCR扩增phb2基因时，为了使PCR产物能被限制酶切割，以便构建基因表达载体，可以考虑在引物的

5'端

5'端

（填“3'”端或“5'端”）添加限制酶识别序列。而在扩增的phb2基因两端分别引入两种不同限制酶的识别序列是常用方法，对于酶切的phb2基因和载体来说选择两种限制酶切比只用一种限制酶切好的原因是：

可以防止目的基因和质粒的自身环化，也可以防止目的基因和质粒的反向连接

可以防止目的基因和质粒的自身环化，也可以防止目的基因和质粒的反向连接

。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用

T₄DNA连接酶

T₄DNA连接酶

（填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTC CTTAA↑G
Pvit2	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACC CCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
（3）将符合要求的基因表达载体导入工程菌后，可用

抗原-抗体杂交

抗原-抗体杂交

技术检测PHB2蛋白是否合成，通过提取、分离和纯化，从发酵液中获得该蛋白。为防止PHB2蛋白在工程菌细胞中被降解，在发酵过程中应选用

蛋白酶

蛋白酶

缺陷型工程菌作为受体细胞，且在发酵结束后的纯化过程中应添加蛋白酶抑制剂。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，

3

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号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。