环状定点诱变技术通过设计特定引物进行PCR，来实现目标载体的单碱基突变，从而生产出满足需求的质粒载体。质粒 pUC18中含有限制酶 Eam1105Ⅰ（识别序列为5'-GACGGGAGTC-3'）和EcoRⅠ的识别序列。为使质粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ识别，但依然具有氨苄青霉素抗性，现对质粒pUC18第1695个碱基（图方框中的碱基）进行诱变，设计了具有诱变位点的引物P1和不具有诱变位点的引物P2。具体操作流程如图所示。
（1）为使诱变后的质粒不能被限制酶 Eaml105Ⅰ识别，但依然具有氨苄青霉素抗性，选择质粒突变位点时应注意 诱变的位点位于限制酶Eam1105Ⅰ识别序列中，诱变后编码的氨基酸不变或不影响氨苄青霉素基因的正常表达诱变的位点位于限制酶Eam1105Ⅰ识别序列中，诱变后编码的氨基酸不变或不影响氨苄青霉素基因的正常表达。
（2）进行上述PCR反应，缓冲液中需提供pUC18质粒，P1、P2两种引物以及 耐高温DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸耐高温DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。至少经过 22个循环，会出现双链均被诱变的线性质粒。扩增得到的线性质粒需在 T4DNA连接T4DNA连接酶的作用下才能连接成环状质粒。
（3）提取连接产物（环化后的质粒），经过 EcoRⅠ、Eaml105Ⅰ双酶切，然后进行电泳，可根据结果判断质粒pUC18的第1695个碱基诱变是否成功，判断的理由是 诱变后质粒的电泳图谱中只有1条条带，未诱变质粒会出现2条条带诱变后质粒的电泳图谱中只有1条条带，未诱变质粒会出现2条条带。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【答案】诱变的位点位于限制酶Eam1105Ⅰ识别序列中，诱变后编码的氨基酸不变或不影响氨苄青霉素基因的正常表达；耐高温DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸；2；T4DNA连接；诱变后质粒的电泳图谱中只有1条条带，未诱变质粒会出现2条条带
【解答】
【点评】
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发布：2024/5/30 8:0:9组卷：22引用：4难度：0.6
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（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
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