四环素被广泛应用于治疗人及动物的细菌感染，但残留在动物组织、奶制品中的四环素通过食物链进入人体，会对人类健康造成威胁。为保障食品安全和人类健康，科研人员向大肠杆菌体内导入了一些特殊的DNA序列作为生物传感器，从而建立一种简易、灵敏以及准确的四环素检测方法。
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（1）研究者利用如图1所示的原理设计四环素检测传感器（图中GFP为绿色荧光蛋白基因）。当环境中有四环素时，菌体

能

能

（填“能”或者“不能”）发出绿色荧光，原因是

四环素能解除R蛋白对启动子B的抑制作用

四环素能解除R蛋白对启动子B的抑制作用

。因此可以通过检测荧光强弱来判定环境中的四环素浓度。
（2）研究者利用基因工程技术构建含四环素检测传感器的大肠杆菌工程菌。
①利用如图2所示的质粒1和质粒2，构建同时含片段1和片段2的表达载体，可用限制酶E、X和

E、S

E、S

分别处理质粒1和质粒2，再用DNA连接酶连接。（四种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示）

限制酶	E	X	S	P
识别序列及切割位点	5′…G↓AATTC…3′ 3′…CTTAA↑G…5′	5′…T↓CTAGA…3′ 3′…AGATC↑T…5′	5′…A↓CTAGT…3′ 3′…TGATC↑A…5′	5′…CTGCA↓G…3′ 3′…G↑ACGTC…5′

②研究者通过上述方法将所有的启动子和相应基因的DNA片段与载体连接，构建表达载体，导入用

CaCl₂

CaCl₂

处理的大肠杆菌细胞内。经过筛选，获得工程菌。
（3）研究者发现在四环素浓度较低时，随四环素浓度增加，工程菌的荧光强度变化不明显。欲获得检测灵敏度更高的传感器，参照（1）中的原理图，从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入大肠杆菌后筛选，则启动子和基因最合适的组合应为①A②

C

C

③

D

D

，该组合检测灵敏度更高的原因是

添加T7基因，可表达T7RNA聚合酶，其活性比大肠杆菌RNA聚合酶更高，可增强相关基因的表达，sfGFP基因，表达荧光强度和稳定性较高绿色荧光蛋白，进而增强检测的灵敏度。

添加T7基因，可表达T7RNA聚合酶，其活性比大肠杆菌RNA聚合酶更高，可增强相关基因的表达，sfGFP基因，表达荧光强度和稳定性较高绿色荧光蛋白，进而增强检测的灵敏度。

。
Ⅰ.启动子：
①启动子A
②启动子B
③经T7RNA聚合酶特异性诱导开启的启动子
Ⅱ.基因：
A.R基因
B.GFP基因
C.T7基因（表达T7RNA聚合酶，其活性比大肠杆菌RNA聚合酶更高）
D.sfGFP基因（表达荧光强度和稳定性都高于GFP的绿色荧光蛋白）