为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系，为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐基因（RST1）编码链首端到末端（其中一条链）的序列为5'-ATCTACGCGCTCATCCG...（省略3n个核苷酸序列）…CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如图1为构建重组质粒的过程示意图，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶（四种酶的识别序列详见表）。请回答下列问题：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
识别序列及切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	T↓GATCA	CCC↓GGG	↓GATC

（1）为获取更多RST1基因，可通过PCR扩增，在反应体系中加入引物的作用是

与目的基因的模板链配对（结合），使Taq酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链

与目的基因的模板链配对（结合），使Taq酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链

。某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用的引物是

②④

②④

（选填序号）。
①5'-GACTACTCGCGCATCTA-3'
②5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
③5'-GCGATGAGTAACGACGC-3'
④5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
⑤5'-TAGATGCGCGAGTAGGC-3'
⑥5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
（2）若PCR反应未得到任何扩增产物，主要原因有

①②④⑥

①②④⑥

（选填序号）。
①退火温度过高 ②Taq酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg²⁺浓度过低
（3）为将图中质粒A和RST1基因正确连接构建重组质粒B，设计RST1基因的引物时，在两种引物的5'端分别添加

BamHⅠ、SmaⅠ

BamHⅠ、SmaⅠ

酶的识别序列，选用

BclⅠ、SmaⅠ

BclⅠ、SmaⅠ

酶切割质粒A，酶切后的载体和目的基因片段通过

T₄DNA连接

T₄DNA连接

酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应首先在筛选平板培养基添加

四环素

四环素

，再将平板上长出的菌落通过影印接种法（盖章）接种到添加

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的平板培养基上继续培养观察。
（4）从平板上长出的菌落若提取重组质粒B利用Sau3AI进行酶切，最多可以得到

7

7

种大小不同的DNA片段。
（5）图2是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接（启动子顺时针转录），则图中连接处的序列正确的是

Q3

Q3

（填序列编号）。