1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题。
（1）如图1是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。在设计PCR引物时最好添加限制酶 EcoRⅠ和XhoⅠEcoRⅠ和XhoⅠ的识别序列，选择依据是 胰岛素基因中有SalⅠ和NheⅠ的识别序列，选用这两种会破坏目的基因；LacZ基因和氨苄青霉素抗性基因中均有MunI的识别序列，会导致无法筛选；选EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、质粒的自身环化和反向连接，使目的基因和质粒正确连接胰岛素基因中有SalⅠ和NheⅠ的识别序列，选用这两种会破坏目的基因；LacZ基因和氨苄青霉素抗性基因中均有MunI的识别序列，会导致无法筛选；选EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、质粒的自身环化和反向连接，使目的基因和质粒正确连接。
（2）目前，科学家已通过将B链的第28位氨基酸—脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。在改造用BCA法获得的胰岛素基因时，可运用大引物PCR进行定点突变，相关原理如图2所示。
为保证有效抑制胰岛素的聚合，进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是 将CCT改为GAT将CCT改为GAT。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR，要获得带有突变位点的、适于与上图中质粒构建基因表达载体的改良基因，引物应选用大引物两条链中的 ②②（填“①”或“②”）；至少进行 33次循环才能获得双链等长的改良基因。
（3）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了 氨苄青霉素、X-gal氨苄青霉素、X-gal等成分的培养基上，呈现 白白色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】EcoRⅠ和XhoⅠ；胰岛素基因中有SalⅠ和NheⅠ的识别序列，选用这两种会破坏目的基因；LacZ基因和氨苄青霉素抗性基因中均有MunI的识别序列，会导致无法筛选；选EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、质粒的自身环化和反向连接，使目的基因和质粒正确连接；将CCT改为GAT；②；3；氨苄青霉素、X-gal；白
【解答】
【点评】
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发布：2024/8/24 9:0:8组卷：16引用：1难度：0.5
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（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
