红景天中的HMA3基因能编码Cd转运蛋白，科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树，以实现栾树的定向改良，使其增强对Cd的富集能力，从而更有效治理Cd污染。实验的主要流程如下，其中Hygr为潮霉素抗性基因，Kanr为卡拉霉素抗性基因，请回答：
（1）重组质粒的构建、扩增、保存
①从红景天细胞中提取总RNA为模板，进行RTPCR。其中PCR的反应条件：98℃10s,55℃30s,72℃1min,35个循环，其中55℃30s过程称为 复性复性。若模板双链cDNA的数量为a个，经过35个循环需要消耗引物的数量是 2a（235-1）2a（235-1）。
②为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质粒时用 BglⅡ和SpeⅠBglⅡ和SpeⅠ酶切PCR纯化产物（已添加相应酶切位点）及Ti质粒，然后通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。
（2）栾树愈伤组织的诱导
切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加 细胞分裂素和生长素细胞分裂素和生长素（填植物激素的名称），放入培养箱，经过21d的黑暗诱导，茎段经 脱分化脱分化形成愈伤组织。
（3）农杆菌介导转化体系的建立
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加 潮霉素潮霉素的培养基筛选出转化成功的愈伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。
（4）原生质体制备及目的基因的检测和鉴定
①取4g筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含 纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶的酶解液中处理一段时间获得原生质体。
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是 通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定，则可以检测比较转基因栾树与野生型栾树 Cd的富集能力Cd的富集能力。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】复性；2a（235-1）；BglⅡ和SpeⅠ；细胞分裂素和生长素；脱分化；潮霉素；纤维素酶和果胶酶；通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所；Cd的富集能力
【解答】
【点评】
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发布：2024/8/5 8:0:8组卷：8引用：1难度：0.6
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发布：2025/1/5 8:0:1组卷：6引用：1难度：0.7 -
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3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
