Gateway克隆技术是一种快速，高效地构建基因表达载体的方法，是基于λ噬菌体可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换的特点设计的。Gateway克隆技术依赖于BP反应和LR反应，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体，如图所示。请回答下列问题：
（1）为构建基因表达载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增目的基因，用于扩增目的基因的引物需满足的条件是 能与目的基因两端的碱基序列互补配对能与目的基因两端的碱基序列互补配对，为使PCR产物能参与后续交换，需要分别在2种引物上添加相应的attB1和attB2序列，该序列应添加在引物的 5′端5′端（填“3′端”或“5′端”）。
（2）BP反应中，将带有attB1和attB2序列的目的基因与质粒1混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换。该反应体系中可能含有未交换的质粒1和交换后的质粒2，为从体系中筛选出质粒2，使混合体系中的质粒分别转化用Ca2+处理的大肠杆菌，并涂布到含有青霉素的平板上。Ca2+处理的目的是 使大肠杆菌处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态使大肠杆菌处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。理论上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中含有的质粒即为质粒2，理由是 质粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含青霉素的平板上增殖；而质粒1含有ccdB基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖质粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含青霉素的平板上增殖；而质粒1含有ccdB基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖。
（3）LR反应中，将质粒2和质粒3混合，加入LR克隆酶，attL和attR位点之间会发生互换。为从反应体系中筛选出最终的基因表达载体，应将转化后的大肠杆菌涂布到含有 卡那霉素卡那霉素的平板上。获得的基因表达载体除含有图示的目的基因和卡那霉素抗性基因外，还必须有 启动子和终止子启动子和终止子等。
（4）在LR反应体系中，相应片段发生互换后，所得产物 不能不能（填“能”或“不能”）再次互换回到初始状态，原因是 attL与attR序列互换后序列发生改变，而体系中的LR克隆酶具有专一性attL与attR序列互换后序列发生改变，而体系中的LR克隆酶具有专一性。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】能与目的基因两端的碱基序列互补配对；5′端；使大肠杆菌处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；质粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含青霉素的平板上增殖；而质粒1含有ccdB基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖；卡那霉素；启动子和终止子；不能；attL与attR序列互换后序列发生改变，而体系中的LR克隆酶具有专一性
【解答】
【点评】
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发布：2024/7/22 8:0:9组卷：7引用：2难度：0.6
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发布：2025/1/5 8:0:1组卷：6引用：1难度：0.7 -
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3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
