神经生长因子（NGF）对神经细胞的增殖和分化有重要作用，对非神经性细胞的生长和活性有辅助作用，对神经性和非神经性疾病都有良好的潜在治疗作用。科研人员通过转基因方法制备能在腮腺中特异性表达人源神经生长因子（hNGF）的转基因猪，并采集该转基因猪分泌的唾液，分离纯化hNGF用于人类神经性疾病的治疗。回答下列问题：
（1）步骤一：将hNGF基因序列替换位于载体XhoⅠ和NotⅠ酶切位点之间的序列，构建含人源NGF的基因表达载体。该步骤中选择XhoⅠ和NotⅠ两种限制酶的优点是

避免切割后目的基因和质粒发生自身环化，且能保证正确连接

避免切割后目的基因和质粒发生自身环化，且能保证正确连接

，在hNGF基因的两端也必须含有XhoⅠ和NotⅠ酶识别的序列，添加的方法是 在对hNGF基因进行PCR扩增设计引物时，

将两种限制酶的识别序列合成在两种引物中

将两种限制酶的识别序列合成在两种引物中

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（2）步骤二：将基因表达载体导入猪胎儿成纤维细胞。该步骤使用的方法是

显微注射法

显微注射法

，目的是

使hNGF基因进入受体细胞，并在受体细胞中维持稳定和表达

使hNGF基因进入受体细胞，并在受体细胞中维持稳定和表达

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（3）步骤三：重构胚的构建。筛选成功导入重组质粒的猪胎儿成纤维细胞，进行细胞培养，该过程中会出现

细胞贴壁和接触抑制

细胞贴壁和接触抑制

的现象，需要用胰蛋白酶进行处理并及时分瓶培养。获得的细胞作为核供体注入去核的猪卵母细胞中。
（4）步骤四：转基因克隆猪的获得。重构胚发育到桑椹胚或囊胚后经胚胎移植导入代孕猪子宫内，获得的转基因猪的遗传物质来自

猪成纤维细胞的细胞核、去核卵母细胞的细胞质和人的hNGF基因

猪成纤维细胞的细胞核、去核卵母细胞的细胞质和人的hNGF基因

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