纤维二糖酶可以将纤维二糖分解成葡萄糖和其他单糖。将来源于黑曲霉的纤维二糖酶基因 （CB） 和强启动子Pcbh1、终止子Tcbh1构建成重组质粒，获得了高效表达纤维二糖酶的里氏木霉优势菌株。请回答下列问题：
（1）科研人员利用PCR扩增黑曲霉的CB，请完成表格。

PCR项目	相关操作
缓冲液	PCR反应缓冲液中一般要添加① Mg2+ Mg2+
模板、引物、原料和酶	提供DNA模板、2种引物、dNTP和Taq酶
反应过程	每次循环依次分为② 变性、复性和延伸 变性、复性和延伸 三步
循环次数	一次PCR一般要经历30次循环
产物鉴定	常采用③ 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 方法来鉴定PCR的产物

（2）为将CB以正确方向插入质粒需要双酶切。已知CB的α链为转录的模板链，应在图1中引物

2

2

的

5'

5'

端加入EcoRⅠ的识别序列，理由是

a链为转录的模板链，该链在强启动子PcbhI后的方向应为3'→5’，因此引物2应位于CB的上游，为使子链从引物2的3’端延伸，其5’端应构建EcoRI的酶切位点

a链为转录的模板链，该链在强启动子PcbhI后的方向应为3'→5’，因此引物2应位于CB的上游，为使子链从引物2的3’端延伸，其5’端应构建EcoRI的酶切位点

。

（3）为研究磷脂酶（PLC-E）与纤维二糖酶基因表达的关系，研究者构建了高效沉默PLC-E基因的反向双启动子载体，如图3所示，其中TrpC和 Rp2为启动子，eGFP为增强绿色荧光蛋白基因，eGFP的作用是

筛选

筛选

。
实验结果预测和分析：
①转基因里氏木霉菌无绿色荧光，说明PLC-E基因沉默，其机理是

在双启动子作用下，转录形成的两种RNA互补，产生双链RNA，抑制翻译，达到eGFP与PLC-E基因同时沉默的效果

在双启动子作用下，转录形成的两种RNA互补，产生双链RNA，抑制翻译，达到eGFP与PLC-E基因同时沉默的效果

。
②与野生型相比，转基因里氏木霉菌的纤维二糖酶含量显著降低，说明

磷脂酶促进纤维二糖酶基因的表达

磷脂酶促进纤维二糖酶基因的表达

。