红景天中的HMA3基因能编码Cd转运蛋白。科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树，以实现栾树的定向改良，使其增强对Cd的富集能力，从而更有效治理Cd污染。实验的主要流程如图，其中Hyg^r为潮霉素抗性基因，Kan^r为卡拉霉素抗性基因。下表为限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题。

EcoRⅠ	BamHⅠ	HindⅢ	Sau3AⅠ	BglⅡ	XbaⅠ
G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	↓GATC	A↓GATCT	T↓CTAGA

（1）重组质粒的构建、扩增、保存：
①从红景天细胞中提取总RNA为模板，进行RT-PCR，该过程需要加入的酶有

耐高温的DNA聚合酶和逆转录酶

耐高温的DNA聚合酶和逆转录酶

。PCR过程中在循环前常要进行一次94℃、5min预变性，其目的是

增加模板DNA彻底变性的概率（使模板DNA充分变性）

增加模板DNA彻底变性的概率（使模板DNA充分变性）

。
②据以上图表分析，为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，进行PCR扩增HMA3基因时需要在引物的5′端添加限制酶

BglⅡ和HindⅢ

BglⅡ和HindⅢ

的识别序列，以确保目的基因与质粒正确连接。至少需要

3

3

个循环才能获得预期的基因。若模板HMA3基因的数量为a个，进行35个循环后，产物中同时含有两种引物的DNA有

（2³⁵-2）a

（2³⁵-2）a

个。
③通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。其中将重组质粒转入大肠杆菌的主要目的是

让其在大肠杆菌中复制、保存

让其在大肠杆菌中复制、保存

（2）栾树愈伤组织的诱导：
切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加

细胞分裂素和生长素

细胞分裂素和生长素

（填植物激素的名称），放入培养箱，经过21d的黑暗诱导，形成愈伤组织。
（3）农杆菌介导转化体系的建立：
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加

潮霉素

潮霉素

的培养基筛选出转化成功的愈伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。
（4）原生质体制备及目的基因的检测和鉴定：
①取4g筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含

纤维素酶和果胶酶

纤维素酶和果胶酶

的酶解液中处理一段时间获得原生质体。
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是

通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所

通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所

。科学家们已通过蛋白质工程技术制造出了蓝色荧光蛋白，正确的顺序是

②①③④

②①③④

（用下列序号表示）。
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计
③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）
④表达出蓝色荧光蛋白