In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；
②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；
③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；
④将重组质粒导入受体细胞。
回答下列问题。
（1）过程①需要用到的酶是 耐高温的DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶。过程③中，同源序列1与同源序列2中的碱基序列不同，这样设计的好处是 防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化。
（2）为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依据 目的基因与质粒目的基因与质粒序列进行设计。
（3）若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌并培养相同时间，然后采用 稀释涂布平板稀释涂布平板法进行计数，若结果较真实值偏小，原因是 当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落。
（4）与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion技术的优势有 不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。（至少答出两点）
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】耐高温的DNA聚合酶；防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化；目的基因与质粒；稀释涂布平板；当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落；不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏
【解答】
【点评】
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发布：2024/8/9 8:0:9组卷：6引用：2难度：0.6
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发布：2025/1/5 8:0:1组卷：6引用：1难度：0.7 -
2．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6 -
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