phb2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物phb2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。下图1是phb2基因编码区序列以及两端需添加的能被相关酶识别的序列，图2为研究所用表达载体示意图，表格为有关的限制酶种类及识别序列和切割位点。回答下列问题。

限制酶种类	SpeⅠ	PvitⅡ	BamHⅠ	XbaⅠ
识别序列	5'A↓CTAGT3'	5'CAG↓CTG3'	5'G↓GATCC3'	5'T↓CTAGA3'

（1）用PCR扩增phb2基因时，为了使PCR产物能被限制酶切割，以便构建基因表达载体，可以考虑在引物的

5'端

5'端

（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列。据图可推断，扩增α链时需添加的限制酶识别序列以及所用引物的碱基序列是

5'CAGCTGTCATTT3'

5'CAGCTGTCATTT3'

（写出12个碱基并注明方向）。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用

T₄DNA连接酶

T₄DNA连接酶

（填“E。coliDNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）。
（2）构建的基因表达载体中需要使用大肠杆菌蛋白基因的启动子tac,其原因是

tac有利于目的基因在大肠杆菌细胞内表达

tac有利于目的基因在大肠杆菌细胞内表达

。
（3）将转化后的大肠杆菌接种在含

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图3，

3

3

号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中。
（4）在筛选出成功导入phb2基因的大肠杆菌后，经多代培养仍能提取出phb2基因，你认为phb2基因是否已成功转化？你的观点及理由是

不一定，转化是指目的基因成功导入受体细胞并稳定存在和表达，仅提取到phb2目的基因不能说明它能否正常表达

不一定，转化是指目的基因成功导入受体细胞并稳定存在和表达，仅提取到phb2目的基因不能说明它能否正常表达

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