科研人员获取了PHB2蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），利用基因工程的方法使大肠杆菌表达该蛋白，以便进一步检测PHB2蛋白抑制肿瘤细胞增殖和扩散的效果。如图1是phb2基因编码区序列以及两端需添加的、能被相关酶识别的序列，图2为研究所用表达载体示意图，表格为有关的限制酶种类及识别序列和切割位点。回答下列问题：

限制酶种类	SpeⅠ	PvitⅡ	BamHⅠ	XbaⅠ
识别序列	5'A↓CTAGT3′	5'CAG↓CTG3′	5'G↓GATCC3′	5'T↓CTAGA3′

（1）在利用PCR扩增phb2基因时，为了使PCR产物能被限制酶切割，以便构建基因表达载体，可以考虑在引物的

5'端

5'端

（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列。据图可推断，扩增α链时需添加的限制酶识别序列以及所用引物的碱基序列是5'

CAGCTGTCATTT

CAGCTGTCATTT

3'。已知AUG为PHB2蛋白合成的起始密码子，则构建符合要求的表达载体所用的工具酶有PvitⅡ、

XbaⅠ、T4DNA连接酶

XbaⅠ、T4DNA连接酶

。
（2）将符合要求的基因表达载体导入工程菌后，可用

抗原—抗体杂交

抗原—抗体杂交

技术检测PHB2蛋白是否合成，通过提取、分离和纯化，从发酵液中获得该蛋白。为防止PHB2蛋白在工程菌细胞中被降解，在发醉过程中应选用

蛋白酶

蛋白酶

缺陷型工程菌作为受体细胞，且在发酵结束后的纯化过程中应添加蛋白酶抑制剂。
（3）肿瘤细胞通常培养在

95%的空气和5%的CO₂

95%的空气和5%的CO₂

（气体及比例）的恒温培养箱中，将适量PHB2蛋白加入培养液后，若肿瘤细胞

增殖速率减慢（或数量减少）、细胞膜上的糖蛋白减少

增殖速率减慢（或数量减少）、细胞膜上的糖蛋白减少

，则表明该蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖和扩散作用，据此可进一步地深入研究。