科学家应用抗旱基因培育出了耐旱玉米新品系，为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐旱基因（mt1D）编码链首端到末端（其中一条链）的序列为5'-ATCTACGCGCTCATCCG …（省略3n个核苷酸序列）……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如图1为构建重组质粒的过程示意图，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶（四种酶的识别序列详见表），箭头表示转录方向。回答下列问题：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
识别序列及切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	T↓GATCA	CCC↓GGG	↓GATC

​
（1）为获取更多mtlD基因，可采用PCR技术扩增，在反应体系中除加入引物、dNTP、缓冲液、Mg²⁺外，还需要加入

模板、耐高温的DNA聚合酶

模板、耐高温的DNA聚合酶

。某同学设计了如下六种PCR引物，其中适合选用的一对引物是

②④

②④

（选填序号）。
①5′-GACTACTCGCGCATCTA-3′
②5′-ATCTACGCGCTCATCCG-3′
③5′-GCGATGAGTAACGACGC-3′
④5′-CGCTACTCATTGCTGCG-3′
⑤5′-TAGATGCGCGAGTAGGC-3′
⑥5′-CGCAGCAATGAGTAGCG-3′
（2）若PCR反应得到的非特异性扩增产物偏多，从引物设计和温度控制角度考虑，主要原因可能是

退火温度低，引物设计不恰当

退火温度低，引物设计不恰当

。
（3）为将图中质粒A和mtlD基因正确连接构建重组质粒B，设计mtlD基因的引物时，在两种引物的5′端分别添加

BamHⅠ、SmaⅠ

BamHⅠ、SmaⅠ

限制酶的识别序列，选用

BclⅠ、SmaⅠ

BclⅠ、SmaⅠ

限制酶切割质粒A，酶切后的载体和目的基因片段通过

T₄DNA连接

T₄DNA连接

酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应首先在筛选平板培养基添加

四环素

四环素

，再将平板上长出的菌落通过影印平板法接种到添加

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的平板培养基上继续培养观察。
（4）若从平板上长出的菌落中提取重组质粒B利用Sau3AⅠ进行完全酶切，最多可以得到

3

3

种大小不同的DNA片段。
（5）图2是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接，则图中M连接处的序列正确的是

Q3

Q3

，填序列编号）。