基因工程中的载体分为克隆载体和表达载体。克隆载体用来克隆和扩增DNA片段，而表达载体是使外源基因在宿主细胞中有效表达。胡萝卜抗冻蛋白基因（afp）是人类发现的第一个植物抗冻蛋白基因，对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。下表为几种限制酶的识别序列及酶切位点，如图表示构建afp基因表达载体的过程，其中PUCm-T、PBI121为人工改造后的质粒，LacZ基因可用于重组质粒的筛选。

限制酶	识别序列
BamHⅠ	5′-G↓GATCC-3′
EcoRⅠ	5′-G↓AATTC-3′
PstⅠ	5′-C↓TGCAG-3′
XbaⅠ	5′-T↓CTAGA-3′
SmaⅠ	5′-CCC↓GGG-3′

 （1）通过PCR可获得大量的afp基因，PCR 的原理是

DNA半保留复制

DNA半保留复制

，扩增时需选用的引物为

afp的多个A聚合的尾与PUCm-T尾端多个聚合的T可以通过碱基互补配对相连

afp的多个A聚合的尾与PUCm-T尾端多个聚合的T可以通过碱基互补配对相连

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（2）PCR产物往往在引物端含有多个人聚合的尾，而PUCm T尾端由多个T聚合，所以在构建克隆载体时不需要用限制酶处理afp和PUCm-T，理由是

引物1和引物3

引物1和引物3

。
（3）LacZ基因编码的β-半乳糖背酶可催化乳糖的水解，培养基中添加物质IPTG可诱导LacZ基因的表达，将培养基中的白色物质X-gal转化为蓝色物质。据图分析，成功导入克隆载体的大肠杆菌菌落呈

白色

白色

（填“白色”或“蓝色”），理由是

成功导入克隆载体的大肠杆菌中，afp插入LacZ内部，破坏了LacZ基因的结构，无法表达β-半乳糖苷酶，无法将培养基中的X-gal转化为蓝色物质

成功导入克隆载体的大肠杆菌中，afp插入LacZ内部，破坏了LacZ基因的结构，无法表达β-半乳糖苷酶，无法将培养基中的X-gal转化为蓝色物质

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（4）提取大肠杆菌中的克隆载体后，先用EcoRⅠ处理克隆载体，再将两端形成的黏性末端补平，补平后再用XbaⅠ处理，得到了一端平末端，一端黏性末端的afp,同时选用

XbaⅠ和SmaⅠ

XbaⅠ和SmaⅠ

 （从表中选择） 处理PBI121质粒，然后用DNA连接酶将PBI121与alp进行连接，构成afp基因表达载体。在此过程中，使afp的两端形成不同的末端的意义是

可以防止afp倒接，防止afp自身环化

可以防止afp倒接，防止afp自身环化

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