胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图1所示。请据图回答下列问题：
（1）图中①过程需要使用 逆转录逆转录酶，②过程需要用到的酶有 限制酶限制酶和 DNA连接酶DNA连接酶，前者可以切断两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
（2）用图中方法得到的kit基因较少，可以采用PCR技术进行扩增，已知kit基因的部分序列如下：
5'-CGGG ATCCALLAGAATTCCG-3'
3'-GCCCTAGGTLLTCTTAAGGC-5'
根据上述序列设计引物为 BCBC（填字母），以 BamHⅠ和EcoRⅠBamHⅠ和EcoRⅠ（填限制酶）进行双酶切kit基因与质粒pET-28a（+），为了实现目的基因与运载体的连接，则需要在引物的 5’5’端添加限制酶识别序列。
A．5'-GCCCTAGGT-3'B．5'-CGGAATTCT-3'
C．5'-CGGGATCCA-3'D．5'-GCCTTAAGA-3'
（3）为了使重组质粒更易进入大肠杆菌，可以用 Ca2+Ca2+处理大肠杆菌，若要检测kit基因是否在大肠杆菌体内发挥作用，首先需要检测大肠杆菌的 RNARNA（选填“DNA”或“RNA”）。
（4）双酶切kit基因，与质粒pET-28a（+）长度为170bp片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit,上述两种质粒在HindⅢ酶切后片段长度如下表所示，
| 质粒类型 | pET-28a（+） | pET-28a（+）-kit |
| HindⅢ酶切片段 | 1000bp、2550bp | 1000bp、2000bp、700bp |
320bp
320bp
，由此判定kit基因上有2个HindⅢ酶切位点，原因是 pET-28a（+）原有的两个HindⅢ位点被目的基因置换走一个后，得到环状的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段
pET-28a（+）原有的两个HindⅢ位点被目的基因置换走一个后，得到环状的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段
。（5）菌液PCR是直接以菌体热解后的DNA为模板、以目基因两端序列为引物进行扩增的方法，根据凝胶电泳结果可初步鉴定菌落是否含有目的基因。对构建的基因工程菌进行菌液PCR验证，根据初步验证的结果提取大肠杆菌的质粒进行双酶切再验证，结果如图2所示。分析可知，基因工程菌的构建
是
是
（选填“是”或“否”）成功，原因是 菌落PCR与质粒双酶切均获得大小约为320bp的基因片段
菌落PCR与质粒双酶切均获得大小约为320bp的基因片段
。【答案】逆转录；限制酶；DNA连接酶；BC；BamHⅠ和EcoRⅠ；5’；Ca2+；RNA；320bp；pET-28a（+）原有的两个HindⅢ位点被目的基因置换走一个后，得到环状的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段；是；菌落PCR与质粒双酶切均获得大小约为320bp的基因片段
【解答】
【点评】
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发布：2024/7/19 8:0:9组卷：8引用：2难度：0.6
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（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
